應用案例（質量光度計-MP）：質量光度計表征蛋白質相互作用的平衡態(tài)

Characterization of protein interaction equilibria

翻譯整理：北京佰司特科技有限責任公司    

質量光度計定量了溶液中生物分子的質量分布。蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質復合物形成通常是涉及多個成分的多步驟反應。質量光度計是一種新的分子光譜分析方法，它可以監(jiān)測復雜的平衡反應的形成，并評估化學環(huán)境或蛋白質濃度的變化如何影響平衡。質量光度計以單分子方式直接測量樣品中所有蛋白質群體的相對濃度。

從DNA復制到細胞周期控制，蛋白質-蛋白質相互作用對幾乎每一個細胞過程都至關重要。由于蛋白質之間的相互作用主要是非共價的，它們通常以平衡狀態(tài)存在。評估系統(tǒng)在擾動后如何恢復平衡，可以深入了解反應動力學，而相互作用親和力是通過測量平衡時每個組分的相對濃度來確定的。然而，當感興趣的系統(tǒng)包括低濃度下的多個反應或組分時，蛋白質-蛋白質相互作用的研究可能變得復雜。在這些條件下，體積或平均測量值迅速下降。相比之下，質量光度計是一種單分子分析技術，因此它可以直接測量樣本中所有組分的分子質量和相對豐度。在這里，我們使用質量光度計研究形成四聚體的重組蛋白的低聚過程。

表征反應平衡的形成

蛋白質-蛋白質相互作用系統(tǒng)受到干擾后，如總蛋白質濃度的變化，系統(tǒng)會重新平衡。此處研究的重組蛋白主要在高濃度（>100μM）下形成四聚體，但我們研究了其在低nM濃度范圍內的行為，這在生理上更為相關。將樣品稀釋至10 nM后，通過光度測定法檢測到分子量與單體、二聚體和四聚體形式相對應的物種種群（圖1）。其他組分，如三聚體、五聚體和八聚體，也可見，但豐度較低。隨著時間的推移，四聚體的比例減少，而單體的比例增加，直到在大約一小時的培養(yǎng)后達到質量平衡。二聚體的比例隨時間大致保持不變。為了生理相關性，樣品在37°C下培養(yǎng)；質量光度計測量在室溫下進行。在這里，質量光度計提供了一種快速簡便的方法來評估所需的孵育時間，以確保隨后的實驗在平衡狀態(tài)下進行。

量化蛋白質濃度如何影響平衡狀態(tài)

一旦低聚體系達到平衡狀態(tài)，每種蛋白質的相對濃度將隨著總蛋白質濃度的變化而變化。通常，總濃度的增加將有利于形成高階蛋白質復合物，而減少將有利于單體或低階低聚物。質量光度計測定數(shù)據(jù)證實了研究中重組蛋白的這一預期：單體在總蛋白濃度為1-50 nM時Zui豐富，四聚體在100 nM時Zui豐富（圖2）。盡管總蛋白濃度發(fā)生變化，但二聚體比例大致保持不變。在上述示例中，質量光度計有效地測量了生理相關蛋白質濃度范圍內每個低聚物物種的相對豐度。這種測量非常有用，因為低聚物狀態(tài)通常與蛋白質活性直接相關。因此，樣本中低聚物狀態(tài)的知識可以為下游應用的決策提供信息。

評估環(huán)境因素如何影響平衡

環(huán)境的物理和化學性質——如溫度、離子強度或pH值——會影響蛋白質相互作用的平衡。將平衡的重組蛋白樣品從37°C移至較低溫度（室溫）會擾亂系統(tǒng)的平衡，導致四聚體的相對比例隨時間增加（圖3A）。二聚體的比例再次保持不變（數(shù)據(jù)未顯示）。

這些結果強調了在實驗過程中嚴格控制溫度和孵育時間的重要性，并證明快速質量光度計測量對于驗證所研究系統(tǒng)的狀態(tài)很有價值。相反，當重組蛋白在水中而不是在PBS中培養(yǎng)時，單體和四聚體數(shù)量的變化不太明顯。出乎意料的是，我們觀察到二聚體數(shù)量顯著增加，盡管存在其他干擾，但在PBS稀釋樣品中二聚體數(shù)量先前保持不變（圖3B），這說明了通過質量光度計進行單分子方法量化每個組分的重要性。

總的來說，對重組蛋白的三組測量表明，使用質量光度計在單個分子水平上監(jiān)測樣本中的所有蛋白質物種，可以對難以分析的多步驟反應提供有價值的見解。

總結

涉及蛋白質相互作用和其他大分子相互作用的系統(tǒng)通常很復雜，使得體積測量難以解釋。由于其單分子性質，質量光度計通過提供樣品中所有組分的信息克服了這一挑戰(zhàn)（前提是感興趣組分之間的分子質量存在足夠的差異）。質量光度計可在一定時間或條件下輕松監(jiān)測溶液中樣品所有組分的相對濃度，無需任何蛋白質標記或固定。在這種方法的基礎上，最近發(fā)表的文章詳細描述了從質量光度計數(shù)據(jù)計算平衡常數(shù)。